慢病毒载体(lentivirus vector,LV)是实验室常用的病毒包装载体,在基因转染方面具有优势,可以转染分裂期和非分裂期的细胞,基因转染效率高,可以导入较大基因片段等。目前被广泛用于RNAi的研究,为基因功能研究和特定基因表达调节提供了可能性。另外,慢病毒包装在临床中可作为基因治疗载体发挥重要作用。
慢病毒载体
慢病毒属于反转录病毒的一种。慢病毒载体是在人类免疫缺陷型病毒(HIV-1)基础上构建的载体。HIV-1包含3个结构基因gag、env和pol,2个调控基因rev、tat,以及4个辅助基因vif、vpr、vpu和nef。
图1. HIV-1的基因结构。
为了提高生物安全性,慢病毒载体的建立经历了四个阶段:
1、第一代质粒系统。去除HIV基因组中的反式作用蛋白基因序列,包装上含有目标基因的重组载体和能为反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒,共转染包装细胞。
2、第二代的三质粒系统。将HIV基因组中的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列去除,分别克隆到独立的质粒中。三个质粒包括包装质粒(含有CMV启动子)、包膜质粒(含有VSV-G基因,替代env基因,可提高宿主范围)和载体质粒(含有目标基因)。
图2. 第二代慢病毒质粒。
3、第三代三质粒系统。为了提高安全系数,在第二代的基础上去除了HIV所有辅助基因序列,只保留了gag、pol和rev基因。
4、第四代四质粒系统。在第三代质粒的基础上,将env基因独立克隆到一个质粒上,另外,除去tat基因。四个质粒包括pGag/Pol,pRev,pVSV-G,和包含目的基因的载体。
图3. 第三代和第四代慢病毒质粒。
其他病毒载体
除了慢病毒载体,常见的,还有腺病毒,腺相关病毒(AAV)等。腺病毒载体是瞬时表达的载体,基因转染效率高,安全性高,缺点是不能整合到宿主细胞基因组,包装周期长,约6-8周。腺相关病毒安全性高、免疫原性低、具有明显组织嗜性等特点,因此适合临床基因治疗,缺点是包装周期较长,约6-8周。
慢病毒包装简要流程
1、构建含有目的基因的RNAi载体和质粒纯化提取
2、将慢病毒载体和包装系统共转染293T细胞。
3、培养2-3d,收集含有病毒的上清培养液。
4、病毒浓缩和纯化,常见方法包括超滤柱浓缩法、PEG浓缩法、超速离心法和纯化柱法。
5、测定滴度和鉴定目的基因。可抽提蛋白或者RNA,检验外源基因是否表达。
6、病毒分装并置于-80摄氏度保存。反复冻融会降低滴度,冻存超过6个月需要重新测定滴度。
慢病毒包装优势
与化学合成的siRNA(small interfering RNA,小分子干扰RNA)和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比,有很多优点。一方面,慢病毒包装可以替代瞬时表达载体使用,另一方面,包装后的慢病毒可感染传统转染试剂难以转染的细胞,如原代细胞、悬浮细胞和非分裂期状态的细胞,可以整合到被感染细胞的基因组中,实现长时间的稳定表达。
慢病毒载体还具有以下优点:
1. 构建稳定细胞株的载体;
2. CAR-T细胞治疗中的主要载体;
3. 操作简单,包装周期短,2-3周;
4. 可用于转基因、基因敲除和基因治疗等领域。
慢病毒包装应用
1. RNAi
RNAi是慢病毒包装的重要应用之一。RNAi是正常生命体内常见的一种基因调控现象。进化中高度保守的双链RNA诱发的同源mRNA特异性降解的现象,因此起到表达抑制的效果。Lentivirus-RNAi作用持久,不仅可用来研究基因功能,还是肿瘤等疾病的治疗方案之一。
2. 疾病治疗
上面提到RNAi用于肿瘤治疗,除此之外,针对肿瘤发生过程中的异常基因,通过导入有治疗价值的基因片段,可实现目的基因的有效和长久表达,起到肿瘤治疗效果。比如前列腺癌中,导入受雄性激素调控的基因,还可能实现靶向组织表达。
除了肿瘤,慢病毒载体还可以用于其他疾病的治疗,比如神经系统疾病。基因疗法在脊髓受损等多种疾病中已经取得良好效果。
3. 构建转基因模型
转基因模型是研究基因功能、病理变化和药理药效学的重要工具。基于慢病毒载体技术的转基因技术操作简单,宿主细胞反映良好。
参考文献:
1. Daly G, Chernajovsky Y. Recent developments in retroviral-mediated gene transduction[J]. Molecular Therapy, 2000, 2(5): 423-434.
2. 陈琛, 万海粟. 慢病毒载体及其研究进展[J]. Chinese Journal of Lung Cancer, 2014, 17(12): 870.