蛋白N端,C端测序

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几乎所有的蛋白合成都起始于N-端,蛋白质N-端的序列组成对于蛋白质整体的生物学功能有着巨大的影响力。例如N-端序列影响蛋白质的半衰期,同时关联着蛋白亚细胞器定位等,这些与蛋白的功能和稳定性息息相关。对蛋白进行N-端测序分析,有利于帮助分析蛋白质的高级结构,揭示蛋白质的生物学功能。

C端序列是蛋白质和多肽的重要结构与功能部位,对蛋白质的生物功能甚至起决定性作用。此外,由于蛋白翻译后在细胞内需要进一步剪切和修饰,通常不能简单的使用基因序列对C-端或N端做简单的预测,对于蛋白生物制品来说,使用C-端测序必不可少,随着蛋白质组学研究的不断深入,蛋白质C端测序对其功能研究将发挥越来越重要的作用。一些新的蛋白质C端测序方法已建立,提高了灵敏度和重复性,能够在蛋白质组水平应用。

技术原理

蛋白质和多肽N-端测序技术是以Edman化学降解法为基础的,Edman化学降解,其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基的偶联,苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)环化裂解,和噻唑呤酮苯氨(ATZ)转化为苯异硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)三个主要的化学步骤,每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基,同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一个Edman降解,最后通过转移的PTH-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定。

Edman 测序示意图

尽管Edman法技术已近乎完善,但仍有不尽人意之处,例如Edman降解法不能解决N端封闭的测序问题(环化、封闭)、被修饰的蛋白不能给出确切的信号,要求蛋白或多肽的纯度在95%以上,灵敏度较低。质谱法不受N末端封闭的限制,能对侧链基团翻译后加工或化学修饰进行定位,灵敏度很高,因而具有其独特优势,与传统的Edman降解法相互补。

质谱测序

蛋白质的C末端分析,并不能采取类似N端氨基酸序列分析的化学分析。无论是国内要求,还是国外药典,现阶段都是采取质谱法对蛋白质样品的C末端序列分析。其原理为利用蛋白质在质谱中会有规律的破碎,获得蛋白质肽段的碎片,分析图谱得到蛋白质的C-端序列。

样品要求:
  • 蛋白质样品可以是干粉、溶液或固定在PVDF膜上(转膜的蛋白质分子量最好不超过20KD,最好用丽春红染色);
  • 样品浓度及纯度:浓度>50pmo l,纯度>90% (建议提供的样品量为所需量的5倍以上);
  • 含盐量:不挥发无机盐<5mM ,挥发性无机盐<20mM ,不能使用Tris 缓冲体系